HPLC法测定阿莫西林舒巴坦酯片人体血药浓度

发布时间:2014-10-20 14:23:04 浏览次数:
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       作者:郭立斌,孙华辈 曲福    编辑:studa20

   【摘要】 目的 建立阿莫西林舒巴坦酯片中阿莫西林和舒巴坦的血药浓度测定方法。方法 以色谱柱为Spberiserb ODS(Φ3.9mm×200mm,5μm);流动相为乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5);流速为0.8ml/min;检测浓度为225nm;柱温为(25±0.1)℃方法测定人体内阿莫西林血药浓度。以色谱柱为Hypersil C18(Φ4.6mm×200mm,5μm);流动相为乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5);流速为1.2ml/min;检测波长为210nm;柱温为(25±0.1)℃方法测定人体内舒巴坦血药浓度。结果 阿莫西林和舒巴坦在选定的色谱分离条件下,与血浆中杂质峰分离良好,分离度大于1.5。阿莫西林血浆药物浓度在0.125~10μg/ml范围内线性良好,r=0.9998;舒巴坦血浆药物浓度在0.10~10μg/ml范围内线性良好,r=0.9999。阿莫西林和舒巴坦的平均回收率分别为96.25%、102.3%。两种成分的日内、日间RSD<10%。结论 HPLC法测定方人体内阿莫西林和舒巴坦血药浓度方法准确度精度和灵敏度均较高,符合血浆中药物测定要求。

      To detect human blood concentration of amoxicillin and sulbactam with HPLC

    【Abstract】 Objective To set up the detection method of human blood concentration of amoxicillin and sulbactam. Methods The chromatographic column was Spberiserb ODS(φ3.9mm×200mm.5μm ),and the mobile phase was acetonitrile- 0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5),the flow rate was 0.8ml/min,the detection wavelength was 225nm,and the column temperature was 25±0.1 ℃.We detected the human blood concentration of amoxicillin,the chromatographic colum was Hypersil C18(φ4.6mm×200mm 5μm),the mobile phase was acetonitrile-0.068mol/L KH2po4(4.5:95.5),the flow rate was 1.2ml/min,the detection wavelength was 210nm, and the column temperature was 25±0.1 ℃.We detected the human blood concentration of sulbactam. Results We found that amoxicillin and sulbactam were under the condition of selected chromatographic separation, the resolution of amoxicillin and sulblactam and the impurity in the blood plasma was favorable.The resolution was <1.5,the human blood concentration of amoxicillin was 0.125~10μg/ml, and the linear regrossion was favorable,r=0.9998.The human blood concentration of sulbactam was 0.10~10μg/ml,and the linear regrossion was favorable,r=0.9999.The average recovery of amoxicillin and sulbactam were 96.25%and 102.3%.The two kinds of components were RSD<10%in a day or next.Conclusion The study shows that we can detect the human blood concentration of amoxicillin and sulbactam with HPLC,and the method has very good accuracy,precision and sensitivity.It is accord with demands of drug detection.


    【Key words】 amoxicillin and sulbactam;liquid chromatography;blood concentration


    阿莫西林舒巴坦酯是由阿莫西林和舒巴坦以共价键结合形成的化合物,阿莫西林为广谱的β-内酰胺类青霉素,舒巴坦是β-内酰胺酶抑制剂,无抑菌活性,能够抑制细菌产生的Ⅱ型~Ⅳ型β-内酰胺酶,使阿莫西林免受酶的水解灭活,从而增加阿莫 西林对细菌的敏感性。该药口服后在胃肠上壁被非 特异酯酶分解为阿莫西林和舒巴坦,并吸收进入人体血液循环[1]。临床上主要用于治疗上、下呼吸道感染和皮肤、软组织感染及性病等[2]。本文研究阿莫西林舒巴坦片口服后血浆中阿莫西林和舒巴坦药物浓度测定方法,为该制剂的人体药代动力学和生物学等效性研究及临床用药提供参考。

    1 材料与方法

    1.1 药品与试剂 阿莫西林对照品(中国药品生物制品检定所,含量86.2%、批号0409-9706);舒巴坦对照品(中国药品生物制品检定所,含量99.8%、批号0430-9501);阿莫西林舒巴坦酯片(珠海联邦制药有限公司中山分厂生产,每片含阿莫西林250mg、舒巴坦250mg,批号030418);乙腈为色谱纯;乙醚、磷酸二氢钾、盐酸高氯酸为分析纯;水为超纯水。

    1.2 仪器 waters高效液相色谱分析系统(包括717自动进样器、510低压梯度泵、996PDA二极管检测器,2010色谱管理系统),waters高效液相色谱分析系统(包括717自动进样器、600低压梯度泵、996PDA二极管检测器,2010色谱管理系统);液体快速混合仪(北京长安仪器厂);普通离心机(北京医用离心机厂)。

    1.3 色谱条件

    1.3.1 阿莫西林色谱条件 Spberserb ODS(Φ3.9mm×200mm,5μm),C18预柱;流动相:乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5);流速:0.8ml/min;检测波长:225nm;柱温:(25±0.1)℃;灵敏度1.0AUFS。

    1.3.2 舒巴坦色谱条件 Hyperisil C18 (Φ4.6mm×200mm,5μm),C18预柱;流动相:乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5);流速:1.2ml/min;检测波长:210nm;柱温:(25±0.1)℃;灵敏度0.5AUFS。

    1.4 受试对象与实验设计 健康男性自愿受试者20人,汉族,年龄23~25岁,体重60~70kg,身高168~175cm。经心电、血压、血尿常规及肝肾功能检查均正常并无青霉素过敏史,签署知情同意书者入选,实验前2周禁服任何药物。实验前空腹12h,于早8:00时用250ml温开水送服药物。服药后4h统一食低蛋白低脂肪午餐,观察病房准备危急情况的抢救措施。受试者口服阿莫西林舒巴坦酯片2片(含阿莫西林和舒巴坦均为500mg),于服药前(0h)与服药后10、20、30、45、60、90、120、180、240、420min采静脉血3ml,肝素抗凝,离心取血浆,置于-20℃冰箱中备用。增高药排行榜10强护手get rid of ab fat外用减肥什么减肥产品效果好排行榜什么牌子好排行榜去痘印产品眼影胸部怎么变大润肤生发水排行榜茶树精油祛痘去皱儿童身体护理什么牌子好祛痘唇部精华什么牌子好

    1.5 血浆样品处理与测定

    1.5.1 阿莫西林血浆样品处理与测定 精密量取上述储备血浆样本0.5ml,加入0.5mol/L高氯酸溶液0.5ml沉淀蛋白,旋涡震荡30s,9000r/min离心5min,取上清液50μl,按“1.3.1”项下色谱条件分离,记录色谱图。

    1.5.2 舒巴坦血浆样品处理与测定 精密量取上述储备血浆样本0.5ml,加入0.5mol/L HCl溶液0.5ml,旋涡震荡30s,然后加入3ml乙醚提取2次,每次旋涡震荡60s,3000r/min离心5min,吸取乙醚2.5ml。合并两次提取液,40℃水浴蒸干乙醚,残留物加200μl流动相充分溶解,40μl进样,按“1.3.2”项下色谱条件分离,记录色谱图。

    1.6 血浆样本测定方法学考查

    1.6.1 专一性考查 (1)取阿莫西林对照品溶液进样,按“1.3.1”项下方法进行色谱分离,得阿莫西林对照品色谱峰。另分别取空白血浆、阿莫西林血浆样本和舒巴坦血浆样本,按“1.5.1”项下方法操作,按“1.3.1”项下色谱条件进行色谱分离,记录色谱图。(2)取舒巴坦对照品溶液,进样,按“1.3.2”项下方法进行色谱分离,得舒巴坦对照品色谱峰。另分别取空白血浆、舒巴坦血浆样本和阿莫西林血浆样本,按“1.5.2”项下方法操作,按“1.3.2”项下方法进行色谱分离,记录色谱图。

    1.6.2 标准曲线的制备 (1)阿莫西林标准曲线的制备,精密吸取空白血浆0.5ml,准确加入阿莫西林对照品溶液配制阿莫西林血浆系列浓度(C)为0.125、0.25、1、4、10μg/ml,按“1.5.1”项下方法操作,按“1.3.1”项下方法进行色谱分离,记录色谱峰,得峰面积为(A),以A对C回归,得回归方程。(2)舒巴坦标准曲线的制备,精密吸取空白血浆0.5ml,准确加入舒巴坦对照品溶液配制舒巴坦血浆系列浓度(C)为0.1、0.4、1、4、10μg/ml,按“1.5.2”项下方法操作,按“1.3.2”项下方法进行色谱分离,记录色谱峰,得峰面积为(A),以A对C回归,得回归方程。

    1.6.3 回收率测定 取高、中、低3种浓度的阿莫西林血浆样本5份,按“1.5.1”项下方法操作,按“1.3.1”项下色谱条件进行色谱分离,记录色谱图。得峰面积为(A),将A代入标准曲线方程,计算测得浓度(C),计算阿莫西林血浆样本回收率。另配制高、中、低3种浓度的舒巴坦血浆样本5份,按“1.5.2”项下方法操作,按“1.3.2”项下色谱条件进行色谱分离,记录色谱图。得峰面积为(A),以上述同样方法计算舒巴坦血浆样本回收率。

    1.6.4 精密度测定 按“1.6.3”方法配制阿莫西林和舒巴坦高、中、低3种浓度的血浆样本,照前述方法分别处理阿莫西林和舒巴坦血浆样品及色谱分离,得色谱图峰(A)分别于1日内测定5次和5日内测定5次,计算日内和日间测得浓度(C),求出日内和日间RSD。

    1.6.5 受试者血浆样品测定 (1)阿莫西林血浆样本测定,取“1.4”项下储备的血浆样本,按“1.5.1”和“1.3.1”项下方法操作,得色谱峰面积(A),代入阿莫西林标准线,得阿莫西林血浆样本浓度。(2)舒巴坦血浆样本测定,取“1.4”项下储备的血浆样本,按“1.5.2”和“1.3.2”项下方法操作,得色谱峰面积(A),代入舒巴坦标准曲线,得舒巴坦血浆样本浓度。

    2 结果

    2.1 色谱行为

    2.1.1 阿莫西林的色谱图 见图1。由图1可见血浆中阿莫西林的保留时间为5.58min,与血浆中杂质及舒巴坦色谱峰分离良好,分离度>1.5。

    2.1.2 舒巴坦的色谱图 见图2。由图2可见,血浆中舒巴坦的保留时间为6.710min与血浆中杂质峰分离良好,分离度>1.5。此条件未见阿莫西林色谱峰。

    2.2 标准曲线

    2.2.1 阿莫西林标准曲线 回归方程为C=6.67×10-3+2.43×10-5A,r=0.9998.在0.125~10μg/ml血浆浓度范围内线性良好,最低检测浓度为0.125μg/ml。

    2.2.2 舒巴坦标准曲线 回归方程为C=2.43×10-3-3.13×10-4A,r=0.9999。在0.1~10μg/ml血浆浓度范围内线性良好,最低检测浓度为0.1μg/ml。

    2.3 回收率测定 阿莫西林和舒巴坦血浆回收率测定结果见表1。从表1可见两药回收率均在95%~105%范围内。

    2.4 精密度测定 阿莫西林和舒巴坦的血浆精密度结果见表2。由表2可见两药日内、日间RSD<5%。 表1 阿莫西林和舒巴坦方法回收率 表2 阿莫西林和舒巴坦日内和日间变异


    2.5 血浆样品测定 20份血浆样品测定结果见表3。由表3可见,受试者口服阿莫西林舒巴坦酯片2片后60min阿莫西林血药浓度达高峰,高峰浓度为4.55μg/ml。45min舒巴坦血药浓度达高峰。高峰浓度5.63mg/ml。表3 阿莫西林和舒巴坦血药浓度

    3 讨论

    本实验建立了阿莫西林舒巴坦片中阿莫西林和舒巴坦血浆药物浓度的反相高效液相色谱测定方法。利用Spberiseb ODS色谱柱及乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5)流动相系统,能够将血浆中杂质、血浆中舒巴坦和阿莫西林有效分离,分离度均大于1.5,且阿莫西林的柱效大于3000。利用Hypersil C18色谱柱及乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5)流动相系统,能够将血浆中杂质与血浆中舒巴坦有效分离,分离度大于1.5,且舒巴坦柱效大于3000,而在舒巴坦的提取方法和色谱分离条件下,阿莫西林无法检测色谱峰,所建立的方法对血浆中阿莫西林和舒巴坦测定专一性强。用0.5mol/L高氯酸直接沉淀血浆蛋白,取上清液测定阿莫西林血浆药物浓度,方法简便,最低检测浓度能够满足阿莫西林血浆样本测定要求。用盐酸使血浆样本酸化,再用乙醚提取游离的舒巴坦,水浴蒸干后用流动相溶解进样,提高了舒巴坦血浆样本的最低检测浓度,满足了舒巴坦血浆样本测定要求。阿莫西林和舒巴坦血浆药物测定的方法平均回收率分别为96.25%和102.3%,日内、日间RSD均小于10%,该方法适合于阿莫西林和舒巴坦血浆药物浓度测定。对20名自愿受试者进行了不同时间的血药浓度的测定,进一步证明了该方法的可行性,也为阿莫西林和舒巴坦制剂的药物动力学和生物等效性研究提供参考。

    【参考文献】

    1 金锐,刘红梅,马霜,等.国产舒他西林胶囊的相对生物生用度.中国药学杂志,1999,4:255-256.

    2 Friedel HA,Campol-Richards DM,Goakl.Sultami-Cillin-arevien of its antibacterial activity, Pharma-Cckinetic properties and therapeutic use .Drugs,1990,37:49-50.